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沙門氏菌PCR檢測試劑盒

沙門氏菌PCR檢測試劑盒
【產品名稱】
     通用名稱:沙門氏菌PCR檢測試劑盒
     英文名稱:Diagnostic Kit for Salmonella (PCR)
【預期用途】
本試劑盒主要用于檢測各種疑似樣品中的沙門氏菌(Salmonella),適用于沙門氏菌的檢測、診斷和流行病學調查。

 

【檢測原理】
    本試劑盒針對沙門氏菌特有基因片段設計特異性引物,采用柱式法提取DNA,并以之為模板,在Taq聚合酶作用下,經PCR擴增目的片段,使目的基因增加百萬倍,經瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察判定,實現對沙門氏菌的快速檢測。
【試劑盒組份】
1、試劑盒組成及貯藏條件
名稱 20份 貯藏條件
1、0.2 mL PCR管 25個 冷藏
(A盒)
2、消化液 4ml
3、結合液 6ml
4、吸附柱 20個
5、收集管 20個
6、洗液 2*10ml
7、洗脫液 500μL
8、TAE緩沖液(50×) 20ml
9、陽性對照 50μL -20℃
(B盒)
10、陰性對照 50μL
11、PCR反應液 350μL
12、蛋白酶K 220μL
    2、有效期:6個月。
    3、需自備材料:生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無菌注射器、無菌1.5mL離心管和吸頭、瓊脂糖、DL2000、染色液。
【操作步驟】
    一、樣品制備
1、拭子樣品:用棉拭子沾取疑似感染人或動物的糞便、尿液等于生理鹽水中,低溫保存送檢;
2、組織樣品:采集胃、腸道、淋巴結、肝臟等疑似病變組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨,再加少量生理鹽水混勻,4℃條件下8000rpm,離心1min,取上清于滅菌離心管中待檢。
    3、樣本要求:采樣量要足夠進行一次復檢,運輸、儲存過程確保低溫,盡量避免反復凍融,檢測前需充分解凍。
    二、DNA的提取
    1、向無菌的1.5ml EP管中分別加入樣品液100μL、消化液 200μL(用前37℃溫育使之充分溶解),蛋白酶K 10μL充分混勻,56℃水浴30~60min;
    2、取出樣品管,降到室溫,分別加入結合液300μL,混勻,將全部液體加入套有收集管的吸附柱中(注意勿吸到雜質,以免堵塞柱子),12000rpm,離心1min;
    3、棄收集管液體,向吸附柱中加500μL DNA洗滌液,4℃條件下12000rpm,離心1 min;
    4、重復步驟3;
5、棄收集管液體,瞬離以徹底去除殘留液體;
6、將吸附柱轉入新的EP管中,柱中央滴加20 μL洗脫液,靜置2min,4℃條件下12000rpm,離心2 min,EP管中液體即為DNA溶液;
    三、PCR擴增
    1、配液:取出PCR反應液,在室溫融化后,瞬離,按15μL/管分裝到PCR反應管中;
    2、加樣擴增:分別向PCR管中加入5μL樣本DNA或陰性對照或陽性對照,在PCR儀上運行以下程序:94℃ 5 min;94℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環;72℃ 7 min。
    四、電泳鑒定
    1、制膠:用50倍TAE電泳緩沖液稀釋到1倍后配制適量1.0%瓊脂糖凝膠;
    2、電泳:直接取5μL~10μL RT-PCR產物或DL2000直接點樣于凝膠孔中,以5 V/cm電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳;
    3、染色、觀察:將電泳好的凝膠放在加有染色液的1倍TAE緩沖液中浸泡數分鐘,取出(小心污染)在紫外燈下觀察結果,進行判定并做好檢測記錄。
【結果判定】
1、成立條件:陽性對照出現495 bp條帶,陰性對照無目的帶時,試驗結果成立。
2、結果判定:被檢樣品出現495 bp條帶為沙門氏菌陽性;否則為陰性。
【注意事項】
    1、實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書,嚴格按操作步驟執行;不使用本試劑盒提供的組分或不按照說明書進行實驗將可能導致錯誤結果。
    2、實驗室管理應嚴格按照國家有關臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。實驗人員須為專業人員,實驗過程應分區進行,每個階段使用專用的儀器和設備;各區間人員流動及空氣流向應有嚴格要求;實驗用消耗品應有合理的清潔和質檢程序,避免環境或物品污染PCR殘留產物導致假陽性結果,避免核酸酶污染或擴增反應抑制物造成假陰性結果。
    3、所有病料相關容器應盡量潔凈、無菌、低溫條件保存;完成樣本核酸提取后,建議馬上進行下一步試驗,短期可保存于-20℃,長期應保存在-70℃。
    4、操作臺、移液器、離心機、耗材等儀器用品應經常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實驗房間、超凈工作臺應定期或每次實驗后用紫外燈處理。
    5、所有試劑應在規定的溫度儲存,凍存試劑使用前應于室溫下完全融化,使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒,應于室溫下避光保存,操作時應戴上手套,相應操作結束后手套要處理掉,不能再接觸其它任何物品,以減少污染區。
    7、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    8、實驗產生的廢棄物、標本及提取物等應及時收集,遠離PCR實驗室才能進行無害化處理。

 


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